菌落PCR出現(xiàn)假陽性的原因：可能使用了錯(cuò)誤的PCR鑒定引物、樣品間交叉污染、PCR試劑的污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染、氣溶膠污染以及實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染。?


?1.使用了錯(cuò)誤的PCR鑒定引物?：


在進(jìn)行菌液PCR時(shí)，如果使用了基因特異引物，可能會(huì)從游離的目的片段DNA上擴(kuò)增出條帶，而不是從重組質(zhì)粒上，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。推薦使用一對載體通用引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，以減少假陽性的發(fā)生?。


2. ?樣品間交叉污染?：


樣品污染可能由于收集樣本的容器被污染、樣本放置時(shí)密封不嚴(yán)溢于容器外、容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染。此外，樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染也可能導(dǎo)致標(biāo)本間污染?。


?3.PCR試劑的污染?：


在PCR試劑配制過程中，加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染，也是造成假陽性的原因之一?。


?4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染?：


PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。極微量的PCR產(chǎn)物污染就可形成假陽性?。


?5.氣溶膠污染?：


在空氣與液體面摩擦?xí)r可形成氣溶膠，劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管、開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題?。


?6.實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染?：


由于克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，且在純化過程中需用較多的用具及試劑，活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大，這也是造成假陽性的一個(gè)重要原因?。


為了避免假陽性的出現(xiàn)，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧p少上述各種污染的可能性，如使用正確的PCR鑒定引物、嚴(yán)格操作規(guī)范、避免交叉污染等?。