一、實驗目的和原理

目的：學會交聯(lián)法制備固定化酶的操作技術

內(nèi)容：制備固定化酶的方法很多，利用雙功能試劑或多功能試劑在酶分子間，酶分子與惰性蛋白間，或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應，以共價鍵制備固定化酶的方法稱為交聯(lián)法，本實驗即采用這種方法。交聯(lián)劑為戊2醛，載體為甲殼素。

二、實驗器材

1．恒溫水浴鍋

2．恒溫振搖儀

三、實驗試劑

1. 5%戊2醛

2. 甲殼素

3. 碘原液：稱取碘1.1g。碘/化鉀2.2g，置于小燒杯中，加10ml蒸餾水使之溶解，然后轉(zhuǎn)入容量瓶中。再加少量的蒸餾水洗滌燒杯數(shù)次，洗滌液均轉(zhuǎn)入容量瓶中，最后定容至50ml。搖均后放于棕色試管中備用。

4. 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘/化鉀20g，再用蒸餾水定容至5000ml。

5. 2%淀粉溶液：稱取2g可溶淀粉，放入小燒杯中，加少量蒸餾水做成懸浮液。然后在攪拌下注入沸騰的蒸餾水中，繼續(xù)煮沸一分鐘，冷卻后加蒸餾水定容至100ml。

6. pH6磷酸/氫二鈉——檸檬酸緩沖液：稱取磷酸二/氫鈉（Na2HPO4.12H2O）45.23g,檸檬酸（C6H8O7.H2O）8.07g,先在燒杯中使之溶解，然后轉(zhuǎn)入容量瓶中定容至1000ml。

7. 標準終點色溶液，

A液：精確稱取lv化鈷（CoCl.6H2O）40.2493g和重洛酸鉀（K2GrO7）0.4878g，用蒸餾水定容至500ml.

B液:：精確稱取絡黑T40mg，用蒸餾水定容至100ml.

同時取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用?；旌弦涸?5天內(nèi)使用有效。

四、實驗操作

（一）酶液的制備

精確稱取α-淀粉/酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸/二氫鈉——檸檬酸緩沖液溶解，溶解過程中輕輕用玻璃棒搗研。將上層液小心傾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述緩沖液，如此反復搗研3—4次。最后，將溶液與殘渣全部移入容量瓶中，用緩沖液先定容搖勻后，通過四層紗布過濾，溶液供測定使用。

（二）固定化酶的制備

1. 稱取50mg粉末甲殼素，加入5%戊2醛10ml，調(diào)節(jié)pH=8.5，攪拌均勻后，于25℃，恒溫振搖1小時。取出后，傾去戊2醛，然后以蒸餾水洗滌，傾去清夜，以除去多余的交聯(lián)劑。

2. 取前面制備的酶液10ml，與上述處理的甲殼素混合均勻，25℃，恒溫振搖1小時，然后4℃冰箱放置過夜。

1.取出后，4000rpm離心分離，傾去清液，蒸餾水洗滌，可得固定化酶。

（三）固定化α-淀粉/酶活力測定及活力回收率的計算

1. 首先用吸管取1ml的標準終點色溶液，加至白瓷板的空穴內(nèi)，作為終點參照的標準。

2. 固定前總酶活力測定：取20ml 2%的可溶淀粉液與5mLpH6的磷酸/氫二鈉——檸檬酸緩沖液，加入一支大試管中。將試管置于60℃水浴5分鐘。然后加入前面制備的酶液0.5ml。搖勻后，立即用秒表記錄時間。此后，每經(jīng)一段時間，用吸管吸出0.2ml反應液，加入預先盛入稀碘液的白瓷板中。當穴內(nèi)顏色反應由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色并與標準色相同時，即為反應終點，記錄反應到達終點時的時間。

3. 固定化酶活力測定：取20ml 2%的可溶淀粉液與5mLpH6的磷酸氫/二鈉——檸檬酸緩沖液，加入一支大試管中。將試管置于60℃水浴5分鐘。然后加入前面制備的固定化酶。搖勻后，立即用秒表記錄時間。此后，不斷振搖，每經(jīng)一段時間，用吸管吸出0.2ml反應液，加入預先盛入稀碘液的白瓷板中。當穴內(nèi)顏色反應由紫色逐漸變?yōu)榧t棕色并與標準色相同時，即為反應終點，記錄反應到達終點時的時間。

4. 酶活力計算：以60℃、pH6的條件下，每小時水解1g淀粉的酶量為一個活力單位。

固定前原酶活力單位 = 60/T×20×2%×n/0.5

固定后的酶活力單位 = 60/T×20×2%×n/10

T：反應到終點時的時間（分）

n：酶粉稀釋的倍數(shù)

5. 固定化后酶活力回收率計算：

酶活力回收率=（固定后的酶活力單位/固定前原酶活力單位） × 100%

五、注意事項

測定酶制劑時，應先在40℃水浴中懸浮2小時，再用紗布過濾。每次操作所用的紗布數(shù)要一致。