關(guān)于實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，最常見的應(yīng)用是通過RT-qPCR進(jìn)行基因表達(dá)分析、疾病診斷和管理（如病毒定量）、食品檢測（如轉(zhuǎn)基因或過敏原分析）以及動物或植物育種等研究。這種方法非常靈敏，因此為了得到可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，避免錯誤是十分重要的。RT和qPCR數(shù)據(jù)評估的整個工作流程包括以下幾點(diǎn)：
1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計
2、樣品的制備和提取/純化
3、RT和qPCR
4、數(shù)據(jù)評估
在以上過程中，實(shí)驗(yàn)人員有可能因?yàn)椴僮麇e誤或失誤導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的失真。但往往有些錯誤的來源又十分不明確，所以排除故障的第一步是需要再次檢查實(shí)驗(yàn)流程并重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計
RT或qPCR反應(yīng)的第一個重要步驟是測定PCR產(chǎn)物及驗(yàn)證相應(yīng)的引物和探針。實(shí)時RT-qPCR引物和探針最/有效的設(shè)計是使用引物設(shè)計軟件，大多數(shù)軟件都可以調(diào)整設(shè)置參數(shù)的最佳屬性，以檢索到符合要求的引物探針序列。這些設(shè)置參數(shù)考慮熔化溫度Tm、互補(bǔ)性、二級結(jié)構(gòu)以及擴(kuò)增子大小和其他重要因素。同時建議跨內(nèi)含子設(shè)計引物，避免來自gDNA的干擾，直接得到cDNA片段。對于基因特異性引物的設(shè)計，應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：
擴(kuò)增子大小: 75-200 bp
引物長度: 18-30 bp
GC 含量: 40-60%
解鏈溫度: 55-60℃
3' 端: 1-2 G or C，以具有良好的穩(wěn)定性
不超過3個G or C （可能不匹配）
沒有二級結(jié)構(gòu)，重復(fù)序列或回文結(jié)構(gòu)
濃度: 150-200 nM
樣品的制備和提取/純化
模板的質(zhì)量直接影響到檢測性能，在qPCR結(jié)果的故障排除過程中也需要考慮。首先，組織取樣和保存是實(shí)驗(yàn)可變性的第一個潛在來源。對于基因的定量，必須使用高質(zhì)量的RNA，這意味著需要非常仔細(xì)地檢查RNA的濃度和質(zhì)量。
降解或不純的RNA會限制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的效率，降低產(chǎn)量；部分降解的RNA可能不能給出準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果。核酸應(yīng)從新鮮或立即冷凍的組織中提取和純化；同時建議使用生物學(xué)重復(fù)（至少3個）。RNA或DNA的分離是PCR實(shí)驗(yàn)前的關(guān)鍵步驟。這是必要的，以便提取對所有樣本都是有效的，并得到純化的核酸（DNA，RNA）?？刹捎酶叻直媛虱傊悄z檢測核酸質(zhì)量和分光光度法（A260/A280=1.8和A260/A230=2.0）檢測核酸純度。
另外也要注意，用于PCR制備的工作空間所有臺面及物品都應(yīng)進(jìn)行常規(guī)去污，以防止交叉污染。
逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR
RT-qPCR是一種分析DNA或RNA的高靈敏性工具。當(dāng)PCR擴(kuò)增靶標(biāo)時，錯誤同時被放大?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)化和盡量減少移液步驟來減少PCR反應(yīng)中的技術(shù)錯誤；在無灰塵的干凈環(huán)境中建立反應(yīng)；通過對無模板（水）對照進(jìn)行PCR反應(yīng)，常規(guī)檢查引物和試劑庫存的DNA污染等。
在進(jìn)行qPCR時可能會出現(xiàn)以下故障：沒有擴(kuò)增、qPCR效率多大或過小、Cq值過大、重復(fù)性差、擴(kuò)增曲線異常、非特異性擴(kuò)增等等。
運(yùn)行后的數(shù)據(jù)分析-基線和閾值的設(shè)置
基線校正是去除背景熒光的必要條件?？赡艿脑蚴莙PCR設(shè)備的檢測器噪音，或是不同的樣品量或染料（探針或插入染料）的殘留熒光。所有樣本的基線起點(diǎn)一般從0~3個循環(huán)開始進(jìn)行量化，基線終點(diǎn)是在各個擴(kuò)增曲線起峰位置前的1~2個循環(huán)。為了使實(shí)時RT-qPCR數(shù)據(jù)有意義，應(yīng)在擴(kuò)增曲線的指數(shù)擴(kuò)增階段設(shè)置閾值，閾值自動設(shè)置一般是基線期熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。
