1.常規(guī)的PCR反應(yīng)體系所需試劑

①高壓過的超純水(高壓的目的是使其中的 DNase失活,以免降解模板DNA);

②PCR緩沖液(選用與所用聚合酶對(duì)應(yīng)的緩沖液) ；

③4種dNTP混合物(每種dNTP的濃度為2.5mmol/L);

④引物(引物合成后,用超純水稀釋為10mmol/L);

⑤熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(不同廠家、不同批次的酶可能會(huì)有差異);

⑥D(zhuǎn)NA模板(盡量使用純化后的核酸作為模板)。

2.實(shí)驗(yàn)儀器

PCR熱循環(huán)儀、核酸電泳儀、凝膠成像設(shè)備、離心機(jī)等

PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

(1)戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。

(2)使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。

(3)避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。

(4)操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。

(5)最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。

(6)操作時(shí)設(shè)立陰陽性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。

(7)盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)。

(8)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。