一、無菌準備:
1、提前1個小時打開無菌室紫外燈消毒滅菌、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒;
2、將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種的用具和培養(yǎng)基等進行滅菌;
3、所有無菌操作都需在酒精燈旁操作。
二、培養(yǎng)基配置:
1、LB肉湯:肉湯粉330g、5g葡萄糖、1000ml蒸餾水; .
2、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:瓊脂培養(yǎng)基粉300g、5g葡萄糖、1000ml蒸餾水。
三、倒平板操作:
1、將滅菌過的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。右手拿錐形瓶，使瓶口迅速通過火焰;
2、用左手將培養(yǎng)皿打開-條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10~20ml)倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋，輕輕搖勻。
3、等待平板冷卻凝固(大約需5~10min) 后，將平板倒過來放置，使皿蓋在下，皿底在上。
四、平板劃線操作:
1、將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅;
2、在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開盛有菌液的試管的棉塞;
3、將試管口通過火焰;將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中，沾取一環(huán)菌液;將試管口通過火焰，并塞上棉塞;
4、左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。
5、灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始 往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)域的劃線與第一區(qū)相連。
6、將平板倒置，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
五、稀釋操作:
1、將分別盛有9ml水的6支試管滅菌，并按10~10的6次方(打不出六次方來)的順序編號。
2、用移液管吸取1ml培養(yǎng)的菌液，注入10倍稀釋的試管中。用手指輕壓移液管上的橡皮頭，吹吸三次，使菌液與水充分混勻。
3、從10倍稀釋的試管中吸取1ml稀釋液，注入102倍稀釋的試管中，重復(fù)第2步的混勻操作。依次類推，直達完成最后一支試管的稀釋。注:移液管需要經(jīng)過滅菌。操作時，試管口和移液管應(yīng)在離火焰的1~2cm處。
六、涂布平板操作:
1、將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中;
2、取少量菌液(不超過0.1ml)，滴加到培養(yǎng)基表面;
3、將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8~10s;
4、用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時可轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使涂布均勻。
注意事項:
1、將涂布器末端浸在盛有體積分數(shù)為70%的酒精的燒杯中。取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
2、操作中一定要注意防火!不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。
