【實驗原理】
DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,是分子生物學(xué)研究的主要對象,因此DNA的提取也應(yīng)是分子生物學(xué)實驗技術(shù)中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的工作,那就根本談不上進行分子生物學(xué)方面的實驗。在DNA提取過程中應(yīng)做到:1、根據(jù)不同研究需要,保證結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性；2、盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3、保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機溶劑及高濃度的金屬離子。
核酸的提取關(guān)鍵是去除蛋白質(zhì),通常情況下,先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后,再用有機溶劑抽提,在單價陽離子存在下,核酸在乙醇中形成沉淀。
作DNA或RNA定量時,應(yīng)在260nm和280nm兩個波長下讀數(shù)。在260nm的讀數(shù)用于計算樣品中的核酸濃度,OD值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA,40μg/ml單鏈DNA或RNA及大約20μg/ml單鏈寡核苷酸。根據(jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計核酸的純度。DNA及RNA純品的OD260/OD280值分別是1.8和2.0,如果樣品中污染有蛋白或酚,其OD260/OD280將明顯低于此值,此時無法對樣品中的核酸進行精確定量。
【實驗用品】
1.臺式離心機；電熱恒溫水浴箱；冰箱；紫外分光光度計；一次性塑料手套。
2.微量加樣器(1000μl,200μl,20μl)；Tip頭(1000μl,200μl,20μl)。Tip頭盒(1000μl,200μl,20μl)；Eppendorff管(2ml,1.5ml,0.5ml),Eppendorff管架。
3.DNA提取的相關(guān)試劑:
1)蛋白酶K(10mg/ml),-20℃保存。
2)TE(pH 8.0):10mmol/L Tris.Cl(pH 8.0),1mmol/L EDTA(pH 8.0), 15磅高壓滅菌后室溫保存。
3)10% SDS:10g SDS溶于90ml 水中,加熱68℃助溶,加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2,加蒸餾水定容至100ml,室溫保存。
4)3M NaAc: 800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉,用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2,加水定容至1L,高壓滅菌,室溫保存。
5)飽和氯化鈉,70%乙醇,氯仿
6)飽和酚
【實驗步驟】
飽和氯化鈉抽提法提取外周血DNA
1.取0.5ml抗凝全血,加入0.8ml TE(pH 8.0)混勻；
2.室溫離心,10000rpm ,1分鐘；
3.棄上清,加入0.4ml TE(pH 8.0),混勻,懸浮細胞；
4.加入10mg/ml蛋白酶K 5μl(終濃度100μg/ml),10% SDS 25μl(終濃度0.5%),混勻；
5.37℃水浴消化過夜,或50℃消化4小時；
6.加入1/3體積的飽和氯化鈉,充分混勻,4℃靜置10分鐘；
7.10000rpm離心10分鐘,取上清于另一新管中；
8.加入等體積氯仿,混勻,10000rpm離心10分鐘；
9.取上清于另一新管中,加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2)混勻；
10.加入2倍體積無水乙醇輕輕混合,10000rpm離心1分鐘；
11.棄上清,加入70%乙醇0.5ml,充分洗滌；
12.10000rpm離心1分鐘,棄上清,自然干燥DNA約5分鐘；
13.加入200-250μl TE,-20℃保存；
14.檢測濃度及純度。
酚氯仿抽提法提取外周血DNA
1.外周血反復(fù)凍溶破壞紅細胞,取0.5ml外周血,加入0.5ml PBS混勻后,10000rpm 離心10分鐘；
2.棄上清,加入180μl TE(pH 8.0),20μl 10% SDS, 10mg/ml蛋白酶K 5μl(終濃度100μg/ml)混勻；
3.37℃水浴消化過夜,或50℃消化4小時；
4.加入等體積的飽和酚并充分混勻,10000rpm離心10分鐘；
5.吸取上清液于另一新管中,重復(fù)上一步驟一次；
6.吸取上清液于另一新管中,加入等體積的酚氯仿并充分混勻,10000rpm離心10分鐘；
7.吸取上清液于另一新管中,加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2) 混勻后,加入2倍體積無水乙醇并輕輕混合,可見絮狀乳白色DNA團塊,10000rpm離心10分鐘；
8.棄上清,加入70%乙醇0.5ml,充分洗滌；
9. 10000rpm離心1分鐘,棄上清,自然涼干后加入TE液,-20℃保存；
10.檢測濃度及純度
組織總RNA的提取
1. 將組織用錫箔紙包裹后于液氮中凍10min,擊碎后回收入2ml無菌Eppendorff管中。按50-100mg組織樣品加1ml TRIZOL試劑進行組織勻漿,樣品體積不應(yīng)超過TRIZOL試劑體積的10%；
2.將組織勻漿液在15-30℃放置5min,促使核蛋白復(fù)合物*解離,按1ml TRIZOL,加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15s,15-30℃放置2-3min,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過12000g,離心15min,將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中(上清液約占TRIZOL試劑體積的60%)；
3. 在上清液中按1mlTRIZOL試劑(最初勻漿體積)加入0.5ml異丙醇混勻,15-30℃放置10min,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過12000g,離心10min；
4. 棄上清,70%乙醇洗滌RNA沉淀 (1ml TRIZOL試劑至少加入1ml 70%乙醇),振蕩混勻,在2-8℃,離心轉(zhuǎn)速不超過7500g,離心5min；
5. 室溫或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中(55℃-60℃溫浴10min).
6. 紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度；
7. 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分離總RNA,每孔上樣25μg,65V,2.5h,以檢測RNA的質(zhì)量。
【實驗結(jié)果分析】
1. 計算已提取的DNA的濃度和純度
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