在我們鑒定基因敲除(KO)細(xì)胞是否建立成功時，除了基因水平的測序、PCR等方法外，蛋白水平的Western Blot驗證也是一個重要的方法。特別是對于文章發(fā)表中結(jié)果的呈現(xiàn)，Western Blot圖尤為重要。但在實際實驗的過程中，偶爾也會出現(xiàn)測序鑒定為KO純合子但WB實驗卻有條帶的情況，即蛋白殘留。那么基因敲除細(xì)胞時蛋白殘留是如何產(chǎn)生的呢？
 

　　1 由于目的基因的多轉(zhuǎn)錄本引起的蛋白殘留
 

　　基因一般含有多個不同的轉(zhuǎn)錄本，在選擇敲除位點時，有時會很難保證覆蓋所有的轉(zhuǎn)錄本，而未被影響到的轉(zhuǎn)錄本就有可能正常轉(zhuǎn)錄翻譯從而表達(dá)出具有部分功能域的蛋白。因此，我們在設(shè)計KO細(xì)胞方案時，應(yīng)綜合考慮數(shù)據(jù)庫基因信息、文獻(xiàn)，甚至通過預(yù)實驗，從而盡可能地覆蓋多個轉(zhuǎn)錄本，當(dāng)然，這就對方案設(shè)計的人員有較高的技術(shù)和經(jīng)驗要求。
 

　　2 由于基因的可變剪切引起的蛋白殘留
 

　　可變剪切指當(dāng)某個外顯子被破壞或缺失時，其轉(zhuǎn)錄的mRNA前體通過不同的剪接方式產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)多樣性的重要機制。當(dāng)我們構(gòu)建KO細(xì)胞時，敲除位點處外顯子被切割后，包含在內(nèi)含子中的RNA剪接規(guī)則同時被破壞，在一定情況下，缺失的外顯子序列在RNA剪切階段被略過，直接將其上游的外顯子與下游的外顯子相連，形成一種全新的mRNA，從而繼續(xù)蛋白的翻譯。
 

可變剪切發(fā)生機制
 

　　3 外因——Western Blot抗體的選擇
 

　　Western Blot檢測技術(shù)是基于抗原抗體的特異性結(jié)合的原理，且抗體并不是識別整個目的蛋白，而是識別某段特定氨基酸序列或其中某部分功能結(jié)構(gòu)域，即抗體的特異性。因此，在采用Western Blot檢測KO細(xì)胞是否存在蛋白殘留表達(dá)時，如果選擇的敲除位點相對靠后，而抗體與蛋白的結(jié)合區(qū)域若存在于敲除位點之前，便可能會出現(xiàn)抗體與N端殘留蛋白的結(jié)合，從而導(dǎo)致Western Blot檢測條帶的出現(xiàn)。不過對于這種情況，目的蛋白的功能很可能已經(jīng)喪失。
 

　　我們該如何規(guī)避蛋白殘留風(fēng)險？
 

　　首先，也是最重要的，就是gRNA的設(shè)計！gRNA的設(shè)計決定了切割位點的位置，因此gRNA的設(shè)計通常也是避免蛋白殘留問題的關(guān)鍵。特別對于移碼突變的敲除策略，gRNA的設(shè)計更為重要，一般建議設(shè)計3條gRNA，并在cell pool階段根據(jù)切割效率的高低來選擇。
 

　　有g(shù)RNA設(shè)計經(jīng)驗的同學(xué)對那幾個常用的gRNA設(shè)計網(wǎng)站應(yīng)該比較熟悉，但網(wǎng)站設(shè)計的結(jié)果只是一個參考，我們不僅需要綜合多個數(shù)據(jù)庫的設(shè)計結(jié)果、也要結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報道，同時參考常用抗體信息的分析，并根據(jù)實際情況進(jìn)行階段性的WB測試，從而實現(xiàn)所建立的KO細(xì)胞無蛋白殘留。
 

　　另外，對于長度較短、又無法找到合適切割位點的基因，我們也可采取大片段敲除或全敲的策略，確保得到的純合子細(xì)胞蛋白不殘留。